凱氏定氮法,是一種經(jīng)典的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的 方法。其國(guó)標(biāo)規(guī)定的基本檢測(cè)過(guò)程包括: 消化: 樣 品和消化劑、硫酸一同加熱,使蛋白質(zhì)消化分解并 釋放出氨,氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨; 蒸餾: 堿化蒸 餾使硫酸銨中的氨游離; 滴定: 用硼酸溶液吸收后 再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定; 計(jì)算: 根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即得出樣品中蛋白質(zhì)含量。整 個(gè)過(guò)程至少需要 6 h 的時(shí)間,其中消化這一過(guò)程即 至少需要 3～ 4 h ,耗時(shí)較長(zhǎng)且操作繁瑣。為此,我 們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)踐操作總結(jié),對(duì)凱氏定氮法中消 化這一過(guò)程進(jìn)行了改進(jìn),以期達(dá)到簡(jiǎn)化操作,縮短 時(shí)間的目的。

1　方法

1. 1　實(shí)驗(yàn)分組 分為 2 組: 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。兩組在測(cè)定樣本 蛋白質(zhì)含量的過(guò)程中,采用不同的消化方法,之后 的蒸餾、滴定、計(jì)算方法,則完全相同。

1. 1. 1　對(duì)照組: 操作嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)規(guī)定〔1〕進(jìn)行。其 采用的消化方法為小火碳化消化法: 取樣品稀釋液 1. 0mL 與消化劑及硫酸一起加入定氮瓶?jī)?nèi),于瓶口 放一漏斗,將瓶以 45° 角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上加 熱消化,消化過(guò)程要求小火( 400℃) 碳化3 h 左右。

1. 1. 2　實(shí)驗(yàn)組: 采用的消化方法是高溫消化法: 將樣 品稀釋液 1. 0 mL 與消化劑一起加入定氮瓶?jī)?nèi)保持 1 000℃的高溫持續(xù)加熱,其過(guò)程要求保持定氮瓶?jī)?nèi) 液體沸騰,但所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)氣泡不溢出瓶口,同時(shí) 產(chǎn)生的蒸餾水氣體在瓶壁遇冷回流,可以將瓶?jī)?nèi)壁上 的蛋白質(zhì)帶回瓶底進(jìn)行消化,整個(gè)消化過(guò)程大約 1h 。

1. 2　蛋白質(zhì)含量檢測(cè)

1. 2. 1　兩組方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性比較: 分別對(duì) 50 g/L蛋白校準(zhǔn)液(上海申索)及 15 份人血白蛋白 樣品(蛋白含量未知)進(jìn)行兩種方法的蛋白質(zhì)含量 檢測(cè),前者重復(fù) 15 次。

1. 2. 2　實(shí)驗(yàn)組蛋白回收率檢測(cè)(見(jiàn)表 1): 任取 2 種 含蛋白的樣品A 、B(蛋白含量未知) ,每種樣品分別 取3 份各 9. 6 mL,加入 50 g/L 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 0 μ L、 100 μ L、400 μ L 和分別對(duì)應(yīng) 400 μ L、300 μ L、0 μ L 的生 理鹽水,執(zhí)行4 次重復(fù)試驗(yàn),進(jìn)行2 種方法的蛋白質(zhì) 含量檢測(cè)。最后計(jì)算回收率。

1. 3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以 x ±SD 表示,兩組間結(jié)果比較采用配對(duì) 資料的 t 檢驗(yàn)及回歸分析。

2　結(jié)果

2. 1　兩組方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性比較(見(jiàn)圖 1) 對(duì)50 g/L 蛋白校準(zhǔn)液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測(cè)結(jié) 果,國(guó)標(biāo)消化法為 49. 95 g/L±0. 00 g/L,高溫消化 法為 49. 91 g/L±0. 00 g/L,兩種方法無(wú)顯著差異(t =1. 1602, P >0. 05)。蛋白校準(zhǔn)液氮含量檢測(cè)結(jié) 果: 國(guó)標(biāo)消化法為8. 20 g/L±0. 00 g/L,高溫消化為 8. 21 g/L ±0. 00 g/L,2 種方法無(wú)顯著差異( t =
1. 000, P >0. 05)。 對(duì)人血白蛋白樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果, 國(guó)標(biāo)消化法為 97. 61 g/L±0. 57 g/L,高溫消化法為 97. 65g/L ±0. 55 g/L,兩種方法無(wú)顯著差異( t = 0. 5762, P >0. 05)。樣品氮含量結(jié)果: 國(guó)標(biāo)消化法為 15. 6 g/L±0. 01 g/L,高溫消化為 15. 6 g/L±0. 01g/L, 兩種方法無(wú)顯著差異( t =0. 8069, P >0. 05)。 將兩種方法對(duì)蛋白標(biāo)液和樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行 回歸分析(見(jiàn)圖 2) ,得出Y =0. 9987 X +0. 0797 , R2 =0. 9999。
2. 2　實(shí)驗(yàn)組蛋白回收率檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表 1。相對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)偏 差分別 為 1. 7%、 0. 8%、1. 7%和 1. 2%,兩種分別加入 0 μ L、100 μ L、 400 μ L、50 g/L 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的混合樣品回收率分別 為: 98. 0%、97. 5%、98. 0%和98. 5%,平均為 98. 0%3　討論 近年來(lái),對(duì)樣品中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度要 求越來(lái)越高,特別是奶粉的“三聚氰胺”事件發(fā)生以 來(lái),在對(duì)有關(guān)含氮的各檢測(cè)方法中凱氏定氮法的標(biāo) 準(zhǔn)地位也再一次被確定。凱氏定氮法不僅是對(duì)含 氮的有機(jī)化合物定量的標(biāo)準(zhǔn)方法,也是蛋白質(zhì)含量 測(cè)定最經(jīng)典的方法,但其同時(shí)也存在操作步驟多, 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。國(guó)標(biāo)規(guī)定的凱氏定氮法測(cè)定 蛋白質(zhì)含量時(shí),其消化過(guò)程要求小火碳化,溫度約 400℃,待 樣品 呈澄 清透 明后 再繼 續(xù)大 火 消化 30 min ,總消化過(guò)程需要 3～ 4 h ,整個(gè)蛋白檢測(cè)過(guò)程 至少需要 6 h 的時(shí)間。

為了縮短檢測(cè)時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)室采用高溫持續(xù)消 化的方法代替國(guó)標(biāo)的小火碳化消化法,使加熱溫度 保持在1 000℃左右,使消化液處于持續(xù)沸騰狀態(tài), 同時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)泡沫又不溢出瓶口。高溫消化 法使消化過(guò)程縮短為 1 h 左右,使整個(gè)蛋白檢測(cè)過(guò) 程縮短為 3～ 4 h。 通過(guò)高溫和小火碳化兩種消化方法對(duì)樣本蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)并比較,結(jié)果顯示: 兩種測(cè)定方法 在穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性方面無(wú)顯著差異。兩種方法比較 的回歸分析顯示斜率為 0. 9987,接近于 1. 00,顯示 出的比例分析誤差是 0. 13%,這種誤差相當(dāng)于在 50 g/L為-0. 065 g/L,在 100 g/L 為-0. 065 g/L。Y 軸截矩接近于 0,表明固有系統(tǒng)誤差很小,符合實(shí)驗(yàn) 要求。回收率測(cè)定 x =98. 0%,即相當(dāng)于 2%的比 例誤差。這一誤差小于實(shí)驗(yàn)允許的總誤差,再次驗(yàn) 證了該方法具有良好的準(zhǔn)確性。 但本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多次試驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),高 溫消化方法并不適用于免疫球蛋白含量較高的樣 品的蛋白含量檢測(cè),其原因有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述,本研究揭示高溫消化方法檢測(cè)蛋白 含量結(jié)果準(zhǔn)確、快速,較國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法大大縮短 了工作時(shí)間,提高了工作的效率,適于廣泛推廣。