1 抽提法

抽提法是目前世界范圍內(nèi)各行各業(yè)應(yīng)用最為廣 泛的脂肪測(cè)定方法, 其中以索氏抽提法( Soxhlet extractor method) 作為公認(rèn)的多種食品脂肪含量測(cè)定 的經(jīng)典方法。 G B5512-85 和 GB5009. 6-85均將索 氏抽提法規(guī)定為糧食、 植物油料和食品脂肪測(cè)定的 第一標(biāo)準(zhǔn)方法。 抽提法使用特定的脂肪抽提器, 利用脂肪溶于 有機(jī)溶劑的性質(zhì), 選用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑, 將經(jīng)研細(xì) 并包扎的試樣反復(fù)以浸泡或淋洗的方式將脂肪抽提 出來, 直到抽提干凈, 蒸發(fā)并回收溶劑, 通過稱重計(jì) 算結(jié)果。 選用的低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑, 在不同國家、地區(qū)和學(xué) 術(shù)組織間有不同的規(guī)定 。我國規(guī)定用無水乙醚 ( b. p. 34. 6℃ ) , 而有的國家、 地區(qū)和學(xué)術(shù)組織除用 無水乙醚外, 還較多地規(guī)定使用石油醚 ( b. p. 30～ 60℃ ) , 個(gè)別的還用苯。但不管用無水乙醚、石油醚 還是苯作脂肪抽提溶劑, 其抽提物中都或多或少地 存在著游離脂肪酸、固醇、蠟、磷脂及脂溶性色素等 類脂和脂肪伴隨物, 這就是人們通常稱抽提法測(cè)得 的結(jié)果為粗脂肪或乙醚萃取物的原因所在。 抽提法稱重的方法有兩種, 即增重法和減重 法。增重法即稱取抽提瓶質(zhì)量, 根據(jù)抽提瓶在抽提后增加的質(zhì)量來計(jì)算脂肪含量。此法適用于脂肪含 量較高的油料等樣品的測(cè)定, 不然, 抽提瓶質(zhì)量比脂 肪質(zhì)量大得多而使稱量誤差增大。但此法對(duì)抽提瓶 的要求較高, 事先需達(dá)到恒量, 在操作中要嚴(yán)防沾 污, 并用在烘干溶劑時(shí), 常因脂肪氧化增重而使恒量 較難實(shí)現(xiàn)。減重法是稱取濾紙包的質(zhì)量, 根據(jù)抽提 后濾紙包減輕的質(zhì)量來計(jì)算結(jié)果 。此法對(duì)各種糧 食、油料樣品均適用。由于抽提結(jié)束后烘干濾紙包, 不存在烘干除去溶劑時(shí)脂肪氧化問題, 較易達(dá)到恒 量, 并在同一套儀器內(nèi)可同時(shí)抽提幾個(gè)樣品, 不僅可 使測(cè)定結(jié)果的精密度提高, 而且也提高了工作率。 抽提法測(cè)定糧食、油料脂肪含量, 要求樣品有一 定的細(xì)度, 并且干燥無水。不然顆粒太大或含水過 多, 會(huì)影響乙醚、石油醚滲入樣品顆粒內(nèi)部的速度, 從而影響抽提效率。同樣, 所用的乙醚或無水乙醚、 儀器、 濾紙等均應(yīng)無水。當(dāng)乙醚被水飽和后抽提效 果大幅降低, 并且水還可將試樣中的水溶性成分溶 出, 使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生正誤差。同理, 半固態(tài)或液態(tài)樣 品不能直接用此法測(cè)定, 而應(yīng)預(yù)先加海砂等填充劑 在 95～ 105℃下干燥后再測(cè)定。依據(jù)抽提法所用抽 提器的不同, 有以下幾種抽提方法。 

1. 1 索氏抽提法 此法為測(cè)定脂肪的經(jīng)典方法。所用儀器稱索氏 抽提器, 由抽提筒、抽提瓶和冷凝器 3部分組成, 各 部分間磨砂密合。抽提瓶?jī)?nèi)盛放抽提溶劑, 經(jīng)水浴 或燈泡加熱裝置加熱, 使溶劑不斷蒸發(fā)。抽提筒內(nèi) 盛放用濾紙包好的試樣, 筒的一側(cè)有一較粗的導(dǎo)管, 溶劑沿此管進(jìn)入冷凝器;筒的另一側(cè)有一較細(xì)的管 稱回流管, 當(dāng)自冷凝器回滴的溶劑液面超過回流管

頂端時(shí), 抽提筒內(nèi)的有機(jī)溶劑連同溶出的脂肪一并 被虹吸出來, 流回抽提瓶。如此反復(fù)抽提多次, 即可 將樣品中的脂肪抽提干凈。 由于糧食、油料中的脂肪多為游離態(tài), 故索氏抽 提法測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確。但此法存在著很大的不 足, 即抽提時(shí)間很長, 如對(duì)含油量較高的油料樣品需 8～ 12h 才能抽提完畢, 不能很好適應(yīng)生產(chǎn)上的需 要, 因而各種改良的索氏抽提器便應(yīng)運(yùn)而生。 

1. 2 直滴式抽提法 此法為索氏抽提法的改進(jìn)方法, 由美國人 Bott 提出, 也稱勃氏抽提法, 最早用于石油化工上。此法 所用的儀器仍由抽提瓶、 抽提筒和冷凝器 3部分組 成, 但對(duì)其中的抽提筒作了較大的改進(jìn): 去掉虹吸管 和溶劑蒸氣導(dǎo)管, 打通抽提筒底部與抽提瓶直接相 通, 樣品包通過一直形漏斗擱于抽提筒當(dāng)中。當(dāng)抽 提瓶?jī)?nèi)溶劑受熱蒸發(fā)時(shí), 溶劑蒸氣通過樣品包四周 進(jìn)入冷凝器, 使樣品溫度有所提高, 從而提高脂肪在 有機(jī)溶劑中的溶解度, 加快抽提速度。更為重要的 是, 當(dāng)溶劑蒸氣冷凝后直接滴落在樣品包上, 經(jīng)淋洗 樣品后, 帶著脂肪回到抽提瓶, 這樣大大增加了抽提 次數(shù), 因而加快了抽提速度。一般的油料樣品 2～ 3h 后可抽提完畢, 為使淋洗均勻, 冷凝器出口也改為鋸 齒形。 

1. 3 Tecator 脂肪測(cè)定儀測(cè)定法 盡管直滴式抽提法較索氏抽提法在抽提時(shí)間上 有較大的縮短, 但仍較長, 因而仍不斷促使國內(nèi)外有 關(guān)專家、學(xué)者、儀器生產(chǎn)商對(duì)快速、自動(dòng)脂肪測(cè)定儀 器和方法的研究。瑞典 Tecator 公司生產(chǎn)的脂肪測(cè) 定儀就是其中的一例, 它具有快速、高效 ( 1次可測(cè) 定 6個(gè)樣品) 的優(yōu)點(diǎn)。 測(cè)定時(shí), 將粒度 1mm 以下的試樣裝入提取套 中, 插入主機(jī)內(nèi), 并將溶劑加入抽提杯中。抽提分兩 步進(jìn)行:首先將試樣浸入沸騰的溶劑中浸提 10～ 15min, 使大部分脂肪溶出;然后將試樣位置升高, 離 開溶劑, 用 由冷凝器 冷凝下來的 溶劑淋洗 20min 。抽提結(jié)束后, 關(guān)閉冷凝閥, 幾分鐘后幾乎全 部溶劑被收集到冷凝器中, 溶劑得以回收。開啟空 氣泵及氣化閥, 將最后微量溶劑收集到冷凝器中。 將提取杯在 95～ 100℃下干燥 30min 后, 冷卻, 稱 量, 計(jì)算結(jié)果。 此法通過“預(yù)煮”試樣, 使大部分脂肪在較高的 溫度下溶出, 然后通過淋洗, 將殘余脂肪抽提干凈。其實(shí), 我國山東省聊城地區(qū)糧食局有關(guān)人員在 70 年 代也有原理相同的儀器問世, 整個(gè)抽提也包括預(yù)煮 ( 5min) 和淋洗( 15min) 兩步, 共在 20min 內(nèi)完成, 不 過此儀器仍為手工操作。 

1. 4 減壓抽提法 這是一種快速的脂肪測(cè)定方法, 適合糧食部門 的各類檢化驗(yàn)室應(yīng)用。其方法要點(diǎn)是: 將水力抽氣泵、安全瓶、抽濾瓶、4#砂芯漏斗等 按抽濾要求連接好, 將恒量的稱量瓶放入抽濾瓶 內(nèi)。 稱樣 0. 2～ 0. 3g, 加無水硫酸鈉及玻璃粉各 2g, 研至極細(xì), 將試樣移入 4#玻璃砂芯漏斗 ( 其中預(yù)先 鋪一層 6. 5mm 厚的無水硫酸鈉) 中。加石油醚 3～ 4ml, 徐徐抽氣, 抽干后再加石油醚 3～ 4ml 浸泡、淋 洗, 如此 5 次。此時(shí), 樣品中的脂肪均已溶于石油醚 而被收集在已知質(zhì)量的稱量瓶中。取出稱量瓶, 在 水浴上蒸干溶劑, 烘干, 冷卻, 稱量。 此法與索氏法同時(shí)測(cè)定, 結(jié)果頗為接近。一些 不同脂肪含量的油料測(cè)定結(jié)果見表 1。

此法的操作關(guān)鍵在于研磨, 如研磨不透, 則測(cè)定 結(jié)果偏低。為使樣品較快地研細(xì), 研磨時(shí)需加無水 硫酸鈉和玻璃粉, 其中無水硫酸鈉還有去除樣品、溶 劑中水分的作用。

2 相對(duì)密度法

這是一類脂肪測(cè)定的快速方法, 國內(nèi)外均有應(yīng) 用。其基本原理是用定量的相對(duì)密度較大的有機(jī)溶 劑溶解定量試樣中的脂肪, 經(jīng)壓濾后直接或間接測(cè) 定有機(jī)溶劑與脂肪混合液的相對(duì)密度大小。由于該 混合液相對(duì)密度的大小與其中所含脂肪量成反相關(guān) 性, 因此可以用來測(cè)定樣品中脂肪的含量。

 2. 1 相對(duì)密度瓶法 此法選用α-溴代萘作為溶劑。定量( 10. 0ml) 加入到有定量試樣( 10. 00g) 的研缽中, 用研磨機(jī)混 合研磨, 使試樣成細(xì)膩的糊狀物, 用壓濾機(jī)壓濾糊狀 物得到脂肪與α-溴代萘的混合液。混合液裝于相 對(duì)密度瓶?jī)?nèi), 在經(jīng)恒溫( 40±0. 05℃ ) 處理后, 按相對(duì) 密度測(cè)定方法測(cè)定混合液的相對(duì)密度。通過查對(duì)預(yù) 先制好的“混合液相對(duì)密度與脂肪含量對(duì)照表”或通 過計(jì)算求脂肪含量。 這種方法有方便、快速等優(yōu)點(diǎn), 所預(yù)制的“混合 液相對(duì)密度與脂肪含量對(duì)照表” 根據(jù)索氏抽提法得 出, 只要測(cè)定條件嚴(yán)格控制一致, 就可得到準(zhǔn)確的測(cè) 定結(jié)果。原上海市糧食技工學(xué)校等單位曾專門研制 了專用的研磨機(jī)、壓濾機(jī)和恒溫水浴, 曾在全國, 尤 其是上海、浙江、江蘇等省、市的糧食部門使用。影 響此法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素是樣品的研磨細(xì) 度、研磨時(shí)間和研磨時(shí)的溫度。研磨時(shí)間過長、溫度 過高, 會(huì)引起α-溴代萘的蒸發(fā)損失, 使測(cè)定結(jié)果產(chǎn) 生正誤差。研磨細(xì)度更直接地影響著樣品中脂肪的 溶出速度和溶出率, 然而儀器自動(dòng)研磨, 常常使粘附 在研缽邊緣的試樣難以研透, 從而造成誤差。

 2. 2 Foss-Let 法 Foss -Let 是瑞典的一家世界著名的儀器生產(chǎn) 公司, 他們研制生產(chǎn)的脂肪自動(dòng)測(cè)定儀, 常用來測(cè)定 谷物、油料的脂肪含量。其基本原理和做法是: 定量 試樣與定量較大相對(duì)密度的抽提溶劑( 四氯乙烯, 相 對(duì)密度 1. 6311) 一并裝入儀器固定的金屬筒中, 密 閉, 開動(dòng)振動(dòng)裝置使一黃銅棒上下高速振動(dòng)而搗碎 試樣,將搗成的糊狀物經(jīng)壓濾得脂肪與溶劑混合液, 將混合液置于測(cè)定室內(nèi), 并在其中放一磁性浮子。 因測(cè)定室外的上端有線圈, 通電時(shí)可構(gòu)成磁場(chǎng), 可使 浮子浮起, 調(diào)節(jié)儀器電流大小, 即改變磁場(chǎng)強(qiáng)度, 使 浮子恰好浮起, 所需電流越大, 說明混合液相對(duì)密度 越小, 含油量越多。電流大小通過聯(lián)動(dòng)裝置指示, 可 直接讀出脂肪含量。 此法測(cè)定速度很快, 5～ 10min 可測(cè)一個(gè)樣品,并且結(jié)果重現(xiàn)性好,但此法所用儀器價(jià)格昂貴, 用樣 量大( 50～ 100g) , 而且溶劑用量也大( 120ml) , 成本 很高。因?yàn)樗穆纫蚁┯幸欢ǖ亩拘? 且相對(duì)密度大, 要求室內(nèi)地板附近的墻壁上設(shè)置通風(fēng)設(shè)備。

3 折光計(jì)法

折光計(jì)法是糧食部門油料收購時(shí)常用的方法, 它依據(jù)脂肪溶于有機(jī)溶劑的特性, 選擇某種比脂肪 有較高折光指數(shù)的有機(jī)溶劑 (α-溴代萘, = 1. 65605) 通過研磨將樣品中的脂肪溶解出來, 經(jīng)過 濾后, 用阿貝折光計(jì)測(cè)定混合液的折光指數(shù)。由于 有機(jī)溶劑和試樣都是定量的, 因而混合液的折光指 數(shù)將隨試樣中脂肪含量的增加而減小, 并且這種變 化在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系, 因而可根據(jù)混合液的 折光指數(shù)求得脂肪含量, 也可查對(duì)“混合液折光指數(shù) 與脂肪含量對(duì)照表”求脂肪含量。 影響此法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素與相對(duì)密度瓶 法相同。

4 水解法

由于抽提法、相對(duì)密度法、折光計(jì)法都只能測(cè)得 樣品中游離態(tài)的脂肪, 而不能測(cè)得其中呈結(jié)合態(tài)的 脂肪, 所以對(duì)于含結(jié)合態(tài)脂肪較多的加工食品( 如面 粉制品、魚蛋及其制品) 的脂肪測(cè)定難以得到滿意的 結(jié)果, 而酸或堿水解法可以克服這個(gè)不足。酸、堿水 解法測(cè)得的結(jié)果是游離態(tài)和結(jié)合態(tài)脂肪的總和。 

4. 1 酸水解法 樣品用鹽酸加熱處理, 破壞蛋白質(zhì)、 糖類等組 織, 使結(jié)合態(tài)脂肪游離出來, 再用乙醚-石油醚萃 取, 蒸去醚液即可得到脂肪。 此法是一種古老的方法, 早在 1925 年就被 AOAC 公定方法中收集, 但至今仍在沿用, 我國 GB5009. 6-85 規(guī)定此法為各類食品脂肪測(cè)定的第 二標(biāo)準(zhǔn)方法。適用于固體、半固體、粘稠液或液體食 品的脂肪測(cè)定, 特別對(duì)容易吸濕、結(jié)塊、不易烘干的 食品樣品, 當(dāng)不能用索氏抽提法測(cè)定時(shí), 應(yīng)用此法效 果較好。但磷脂、糖類含量高的樣品不宜。因?yàn)榱字?會(huì)在熱的鹽酸溶液中幾乎完全水解為脂肪酸和堿, 使測(cè)定結(jié)果偏低;而糖類則會(huì)發(fā)生炭化而影響測(cè) 定。此法簡(jiǎn)便、快速, 但準(zhǔn)確度稍差。 

4. 2 堿水解法

此法適用含乳糧油食品或乳、 乳制品中的脂肪 測(cè)定。在方法上與酸水解類似, 只是用堿 ( 濃氨水) 代替鹽酸, 使乳中酪蛋白鈣鹽溶解, 并破壞膠體狀 態(tài), 使酪蛋白鈣鹽包裹的脂肪球游離出來, 再用乙醚 -石油醚混合液萃取。

5 其它方法 糧食、油料中的脂肪含量測(cè)定方法還有一些, 這 里不再贅述。近年, 尚有利用核磁共振原理測(cè)定包 括糧食、 油料在內(nèi)的多種樣品的脂肪的測(cè)定的專用 單機(jī)問世, 但由于儀器價(jià)格、性能、操作者習(xí)慣、結(jié)果

重復(fù)性等原因, 尚未能普遍應(yīng)用。